Гистологическая техника. Методы и техника микроскопирования. Микроскопия - это что такое

Микроскопические методы исследования - способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основусоставляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей - вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других микроскопических методов исследования определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные микроскопические методы исследования . Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1 ). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1 / 4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная. Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее. В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях - отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2 ). Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования , способом микробиологической диагностики , находит применение в цитологических исследованиях и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение - люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей - флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования ). С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3 ). В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400-250 нм ). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов - их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750-1200 нм . Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид микроскопических методов исследования наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии , в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4 ), при сканирующей - объемное (рис. 5 ). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования , позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30-50 нм . Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - способы изучения микроскопического строения различных объектов, размеры к-рых находятся за пределами разрешающей способности глаза. М. м. и. играют важную роль в бактериол., вирусол., цитол., гематол., гистол, и других исследованиях; их применяют также в фармакологии, химии, минералогии, кристаллографии и др. Среди М. м. и. наряду с обычной световой микроскопией широко используют стереоскопическую, темнопольную, интерференционную, фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, электронную микроскопию и др.

Основой для развития М. м. и. явились работы Аббе (Е. К. Abbe) но дифракционным свойствам электромагнитного излучения. С помощью теории Аббе определяют разрешающую способность микроскопов и изготавливают линзы, лишенные хроматической и сферической аберрации, объективы, дифракционные решетки, осветительный и рисовальный аппараты.

Дифракционная решетка Аббе служит для изучения явлений дифракции и состоит из системы тонких прозрачных и непрозрачных чередующихся линий, к-рые прорезают специальным резцом в толще металлического покрытия, нанесенного на стеклянную подложку.

Осветительный аппарат Аббе применяют в микроскопах для освещения объекта в проходящем свете. Он состоит из зеркала (плоского или вогнутого) и конденсора, посредством к-рых поток света направляют в плоскость объекта в виде сходящегося пучка лучей, что обеспечивает более высокую освещенность препарата и улучшает разрешающую способность микроскопа. Конденсор состоит, как правило, из двух-трех линз; ближнюю к объективу линзу устанавливают так, чтобы ее плоская поверхность была параллельна плоскости предметного столика микроскопа. При удалении конденсора от плоскости объекта яркость освещения снижается, однако возрастает контрастность изображения.

Рисовальный аппарат Аббе служит для зарисовки с гистол, препаратов. Он состоит из расположенной над окуляром микроскопа системы стеклянных призм, к-рая направляет в глаз исследователя световые лучи, прошедшие через гистол, препарат и отраженные с помощью зеркала от листа бумаги, лежащей возле микроскопа. Благодаря этому наблюдатель видит совмещенное изображение препарата и своей руки, очерчивающей, напр., карандашом контуры деталей гистол, картины препарата.

При пользовании М. м. и. важное значение приобретает правильная установка освещения, к-рую обычно проводят по методу Келера. Для этого автономный осветитель, напр. ОИ-19, располагают так, чтобы плоскость ирисовой диафрагмы осветителя находилась на расстоянии 15-25 см от центра зеркала микроскопа. Затем через закрытую на 1/2-1/3 диафрагму проецируют изображение нити лампы накаливания осветителя в центр зеркала микроскопа, прикрытого для облегчения наблюдения листом белой бумаги. Изменяя расстояние между микроскопом и осветителем, производят фокусировку изображения нити накаливания и затем зеркалом микроскопа направляют изображение в его объектив. При этом величина освещенного пятна должна совпадать с диаметром апертурной диафрагмы микроскопа, резкое изображение к-рой можно получить, изменяя положение конденсора и плоскости зеркала. В заключение раскрывают апертурную диафрагму микроскопа и с помощью макро- и микровинтов микроскопа получают яркое и четкое изображение объекта.

При работе с малыми увеличениями микроскопа этот способ не всегда позволяет получить полное и равномерное освещение поля зрения. В этих случаях снимают или отводят в сторону фронтальную линзу конденсора, применяют конденсор с большим фокусным расстоянием. При широко открытой апертурной диафрагме микроскопа изображение бывает недостаточно контрастным. В процессе диафрагмирования увеличивается контрастность изображения и возрастает глубина резкости, но может снизиться разрешающая способность микроскопа за счет нарастающих при этом дифракционных явлений. При смене объектива изображение следует снова сфокусировать в фокальной плоскости при закрытой диафрагме осветителя. В случае отклонения оси осветителя от оси объектива микроскопа края изображения могут быть освещены неодинаково. Чтобы освещенность краев изображения стала одинаковой и равномерной по всей площади поля зрения, наблюдая изображение через окуляр, перемещают осветитель.

Установку освещения по методу Келера применяют также при изучении препаратов в так наз. темном поле. В этом случае заменяют обычный конденсор темнопольным и, наблюдая в окуляр, медленно поднимают конденсор до возникновения темнопольного изображения.

Объекты, изучаемые под микроскопом, могут быть прозрачными, а также непрозрачными, т. е. изменяющими амплитудные и фазовые свойства направленного на них электромагнитного излучения. В зависимости от свойств объекта изменяются физ. свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плоскость и направление распространения волны, что используют в М. м. и. Для микроскопического исследования окрашенных объектов применяют световой микроскоп. Цвет изображения и различия в окраске нередко позволяют судить о хим. природе отдельных структур изучаемого объекта, но не дают возможности оценить его жизнедеятельность (движение, хемотаксис, слияние и др.), т.к. при окраске часто используют хим. или температурную фиксацию, убивающую биол, объект, но обеспечивающую эффективное окрашивание. В отличие от исследования фиксированных биол, объектов, витальная микроскопия основана на прижизненном окрашивании, в результате к-рого многие структуры живой клетки мало изменяются под действием специальных красителей. Витальная микроскопия может проводиться и без окрашивания, если в обычный световой микроскоп ввести темнопольный конденсор.

Ультрафиолетовая микроскопия используется в цитол, и гистохимических исследованиях. Она позволяет изучать локализацию, количественное распределение в клетках и тканях высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты) и наблюдать за их динамикой в процессе жизнедеятельности. Этот метод дает возможность без предварительной фиксации и окраски препаратов рассматривать исследуемый материал, напр., с целью прижизненного изучения микрообъектов.

Ультрафиолетовая абсорбционная микроскопия основана на способности нек-рых веществ, входящих в состав тканей и клеток, прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны.

При исследовании живых или фиксированных неокрашенных объектов возрастает контрастность изображения за счет избирательного поглощения ультрафиолетовых лучей высокомолекулярными соединениями. В частности, важное значение ультрафиолетовая микроскопия имеет для изучения распределения в клетке нуклеиновых к-т, поглощающих ультрафиолетовое излучение в участке спектра ок. 260 нм. Поглощение ультрафиолетового излучения белками зависит от входящих в их состав ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина), дающих максимум поглощения в участке спектра ок. 280 нм. Для получения наглядного представления о распределении в препарате веществ изучаемый участок фотографируют в ультрафиолетовом свете с разной длиной волн. В последующем фотоснимки переснимают на цветную пленку в хромоскопе, в к-ром перед снимком, сделанным в коротковолновых лучах, помещают синий светофильтр, в лучах средней длины - зеленый и в длинноволновых лучах - красный светофильтр. Эти снимки с помощью специального приспособления совмещают на экране, и изображение становится видимым, передавая условными цветами различия поглощения ультрафиолетовых лучей отдельными структурами клетки.

Ультрафиолетовую флюоресцентную микроскопию, как и абсорбционную, используют для цитохим, изучения живых или фиксированных неокрашенных объектов, в связи с тем что спектры ультрафиолетовой флюоресценции веществ отличаются друг от друга.

Инфракрасная микроскопия дает возможность установить структуру объекта по характеру поглощения света с длиной волн 800-1000 нм. Широкое распространение имеет исследование в инфракрасном свете веществ, частично или полностью непрозрачных в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для инфракрасной микроскопии биол, объекты не подвергают дополнительной хим. обработке. При помощи инфракрасного микроскопа производят исследование импрегнированной нервной ткани и капилляров в гистол, срезах, распознают повреждения сетчатки и радужной оболочки глаза.

Для повышения разрешающей способности М. м. и. создают оптические системы, основанные на электромагнитных линзах с применением в качестве источника излучения потока электронов, напр, для электронной микроскопии (см.) используют пучок быстрых электронов, а роль линз выполняют электрические и магнитные поля определенной конфигурации. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая (растровая) микроскопия, к-рая дает возможность получить объемное изображение объекта за счет излучаемых им вторичных электронов.

В нек-рых микроскопах плавное, бесступенчатое увеличение без смены объектива позволяет в пределах широкого диапазона установить интересующие детали объекта, напр, динамику биол, процессов, происходящих в тканевых культурах.

Библиография: Аппельт Г. Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959, библиогр.; Биофизические методы исследования, под ред. Ф. Юбера, пер. с англ., М., 1956; Д e Робертис Э., Новинский В. и Саус Ф. Биология клетки, пер. с англ., с. 94, М., 1973; Дитчберн Р. Физическая оптика, пер. с англ., М., 1965; Ильин P. С., Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторные оптические приборы, М., 19 66, библиогр.; Л и л л и Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и д р. Микроскопы, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевский.

Световая микроскопия

При использовании этого метода исследователь оперирует следующими понятиями:

Увеличение – физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра.

Минимальный размер наблюдаемого объекта (d) и разрешение микроскопа – значения, зависящие от характеристик линз объектива, длины волны и от коэффициента преломления среды, отделяющей изучаемый объект от линз объектива или конденсора. Увеличивают разрешение микроскопа применением жидких сред (иммерсионные среды), т.к. коэффициент их преломления больше коэффициента преломления воздуха. В микроскопии используют масляную, глицериновую и водную иммерсионные среды. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа – 0,2 мкм (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта).

Специальные виды микроскопии

Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия - формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флуоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.

Флюоресцирующие красители (флюоресцин, родамин и др.) избирательно связываются со специфическими макромолекулами.

Электронная микроскопия

Теоретическое разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм.

Просвечивающий ЭМ состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки.

Сканирующий ЭМ применяют для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.

Метод сколов (замораживания-скалывания) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе.

В зависимости от свойств объекта свет изменяет свои физические свойства - цвет (длину волны), яркость (амплитуду волны), фазу, используются в современных микроскопах для создания контраста.

Рис. 1. Микроскоп МБИ-3: 1 - ножка, или башмак; 2 - барашки грубого движения тубуса; 3 - тубусодержатель; 4 - окуляры; 5 - бинокулярная насадка; 6 - головка для крепления револьвера с посадочным гнездом для смены тубусов; 7 - винт крепления бинокулярной насадки; 8 - револьвер на салазках; 9 - объективы; 10 - предметный столик; 11 - барашек продольного движения препаратодержателя; 12 - барашек поперечного движения препаратодержателя; 13 - апланатический конденсор прямого и косого освещения; 14 - центрировочные винты столика; 15 - головка винта, фиксирующего верхнюю часть предметного столика; 16 - кронштейн конденсора; 17 - барашек микромеханизма; 18 - зеркало; 19 - коробка с микромеханизмом.

Наиболее легко поддаются окрашиванию фиксированные, убитые препараты. Такие неподвижные препараты могут быть с высокой точностью рассмотрены и сфотографированы через микроскоп, но они не дают возможности оценить различные формы жизнедеятельности микроскопируемого объекта (движение, слияние, фагоцитоз и пр.). Известны красители, которые связываются с живыми клетками, не нарушая их жизнедеятельности.

Витальная (прижизненная) микроскопия показывает, что многие структуры живой клетки сравнительно мало изменяются при умелой фиксации и последующем окрашивании. Этим подтверждается высокая научная ценность информации, получаемой при помощи микроскопии окрашенных объектов. Витальная микроскопия возможна и без окрашивания, если в обычный микроскоп ввести так называемый темнопольный конденсор. Он освещает объект так, что в глаз наблюдателя попадают только те лучи, которые рассеялись на частицах объекта и тем самым изменили направление своего распространения. Лучи, прошедшие через фон без рассеяния, в глаз не попадают. Поэтому частицы объекта светятся и ярко выделяются на темном фоне (темном поле). Частицы объекта хорошо видны, даже если их размеры меньше разрешаемого расстояния.

Темнопольная микроскопия обеспечивает наибольший возможный контраст изображения, но четкость его и полезное увеличение заметно ниже, чем при обычной микроскопии. Темнопольная микроскопия успешно применялась для изучения спирохет, лептоспир и других слабо окрашиваемых микроорганизмов. При работе с гистологическими препаратами она неприменима.

Технически самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии является ультрамикроскопия , при которой мельчайшие изучаемые частицы освещаются мощным боковым пучком света и видны точками на черном фоне. Ультрамикроскопия позволяет подсчитывать частицы, оценивать их размеры и другие свойства. Применяется для изучения коллоидных растворов, аэрозолей, суспензий.

В последние годы темнопольная микроскопия применяется все реже, так как появились два новых типа контрастирующих приборов со значительно лучшими характеристиками - фазово-контрастный (рис. 2, а и б) и амплитудно-контрастный микроскопы. Технически они сходны, но в них используют различные изменения светового луча в объекте. Луч, прошедший через фон образца, в идеальном случае не претерпевает никаких изменений. Он проходит через точно определенные участки объектива. Луч, прошедший через объект, подвергается дифракции, т. е. распадается на пучки убывающей интенсивности, которые выходят из объекта под разными углами. Другие свойства луча (амплитуда, длина волны, фаза) изменяются в различных степенях в зависимости от особенностей объекта.

Рис. 2. Микроскоп МБИ-3 (а) с фазово-контрастным устройством КФ-1 (б): 1 - конденсор револьверной системы; г - набор объективов и кольцевых диафрагм; 3 - вспомогательный микроскоп.

Почти все живые микроскопические объекты выглядят в обычном микроскопе едва заметными, прозрачными, потому что они почти не изменяют ни амплитуды, ни цвета прошедшего через них луча.

Они изменяют только фазу его волны, но это изменение не улавливается ни глазом, ни фотопластинкой. Пучок лучей, дифрагированных объектом и сдвинутых им по фазе, проходит через те участки объектива, где не могут пройти прямые, недифрагированные лучи фона. Практически нетрудно определить, где именно пройдут эти лучи. Если накрыть этот участок одной из линз объектива полупрозрачной пластинкой, способной изменить фазу, интенсивность, цвет или все эти три свойства вместе, то изображение фона изменит свою фазу, уменьшится его яркость или преобразится цвет. Лучи, прошедшие через объект и отклоненные (дифрагированные) им, обойдут вложенную в объектив пластинку и, следовательно, не приобретут тех свойств, которые приобрели, пройдя через пластинку, лучи фона. В результате разница между лучами фона и объекта возрастет. Если разница фаз между лучами фона и объекта достигает 1/4 длины волны, то в конечном изображении возникает заметный для глаза и фотопластинки контраст: темный объект на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры пластинки, которую в этом случае называют «фазовой». Если же пластинка изменяет главным образом яркость и цвет фона, то такой микроскоп следует назвать амплитудно-контрастным (большое распространение получило более короткое, хотя и не совсем правильное название «аноптральный»). Таким образом, разница между фазово-контрастным и амплитудно-контрастным микроскопом определяется свойствами пластинки в объективе, изменяющей свойства недифрагированных лучей фона. Изображения, построенные этими микроскопами, значительно ярче и богаче деталями (рис. 3 и 4), чем темнопольные картины.

Рис. 3. Культура многоклеточной бактерии Caryophanon latum Peshkoff. Амплитудно-контрастная микроскопия.
Рис. 4. Микроколонии Вас. megatherium, зараженной фагом. Амплитудно-контрастная микроскопия.

С появлением фазово- и амплитудно-контрастных микроскопов витальная микроскопия получила прекрасную технико-методическую базу, возможности которой близки к предельным для световой оптики. Никакой фиксации или окраски объекта эти приборы не требуют. Современная витальная микроскопия чрезвычайно расширила наши знания о поведении и динамике живых микрообъектов в естественных и лабораторных условиях обитания и эксперимента. Ускоренная (рапид) и замедленная (цейтрафферная) микрокиносъемка сделали доступными для исследования процессы, скорость течения которых слишком велика или слишком мала для визуального наблюдения.

Выпускаемые промышленностью фазово-контрастные и амплитудно-контрастные (аноптральные) устройства недороги, легко монтируются на серийных микроскопах; использование их не представляет затруднений. Эти приборы, несомненно, будут находить все новые области применения как в научных исследованиях, так и в медицинской практике.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны. Это позволяет наглядно демонстрировать и изучать, в том числе количественно, распределение веществ в живых клетках или фиксированных препаратах. Так, например, белки и нуклеиновые кислоты одинаково прозрачны для видимого света; рассматривая неокрашенную клетку в видимом свете, нельзя определить, где расположен белок или нуклеиновая кислота. Но ультрафиолетовые лучи определенной длины нуклеиновая кислота поглощает значительно сильнее, чем белок. Поэтому в ультрафиолетовом микроскопе участок, содержащий нуклеиновую кислоту, выглядит значительно темнее. Так как ультрафиолетовые лучи непосредственно глазом не воспринимаются, приходится применять специальные преобразователи света. Ультрафиолетовая микроскопия технически значительно сложнее обычной световой, ее аппаратура дороже и методика тоньше. Несмотря на это, применение ее оправдано, так как научная значимость быстрого топографического описания химического состава живой клетки весьма велика.

Гораздо более доступна и перспективна люминесцентная микроскопия (см.), широко применяемая ныне в научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораториях. При этом живой объект обрабатывают специальными красителями, которые, будучи освещены синим, фиолетовым или ультрафиолетовым светом, начинают светиться, излучая более длинные волны (зеленые, желтые). Цвет возбужденного вторичного свечения зависит от химических свойств объекта и введенного в него красителя.

Поляризационная микроскопия основана на изменении плоскости колебаний световой волны после прохождения через кристаллы. В практической медицине не применяется.

Современная микроскопия требует применения разнообразной вспомогательной аппаратуры. Нагревательные столики и термостаты позволяют выдерживать и наблюдать объект длительное время при заданной температуре. Для длительного выращивания микробов или тканевых культур в поле зрения сильного объектива служат разнообразные микрокамеры. Окулярные и объективные микрометры делают возможными точные измерения микрообъектов. Промышленность выпускает микроманипуляторы (см.) для операций на микрообъектах. Для получения стереоскопического изображения при увеличениях до 100 раз предназначены бинокулярные лупы (см.) и стереомикроскопы (рис. 5). Широко производится и используется аппаратура для микрофотографии и микрокиносъемки (рис. 6). См. также Микроскопическая техника.

Рис. 5. Стереоскопический микроскоп МБС-1.

Рис. 6. Микрокиноустановка МКУ-1.

Световая микроскопия. В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль. Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы. И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Виды световой микроскопии:

1) Иммерсионная световая микроскопия. Иммерсионные объективы используются для изучения объектов невидимых или плохо видимых через сухие системы микроскопа.2) Фазовоконтрастная микроскопия предназначена для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля.3) Аноптральная микроскопия – разновидность фазовоконтрастной микроскопии, при которой применяют объективы со специальными пластинками, нанесенными на одну из линз в виде затемненного кольца.4) Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом).5) Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов).6) Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В объектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).7) Люминесцентная микроскопия - метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучамиЛюминесцентная микроскопия. Метод основан на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждаемого люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого и зеленого цвета. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуохромами (акридиновый оранжевый, изотиоционат флуоресцеина и др.). Лучи света от сильного источника (обычно ртутной лампы сверхвысокого давления) пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием этого коротковолнового излучения окрашенные флуохромом клетки или бактерии начинают светиться красным или зеленым светом. Для того, чтобы синий свет, вызвавший люминесценцию, не мешал наблюдению, над окуляром ставят запирающий желтый светофильтр, задерживающий синие, но пропускающий желтые, красные и зеленые лучи. В результате при наблюдении в люминесцентном микроскопе на темном фоне видны будут клетки или бактерии, светящиеся желтым, зеленым или красным цветом. Например, при окраске акридиновым оранжевым ДНК клетки (ядерное вещество) будет светиться ярко-зеленым цветом. Метод люминесцентной микроскопии позволяет изучать живые нефиксированные бактерии, окрашенные сильно разведенными флуохромами, не причиняющими вреда миробным клеткам. По характеру свечения могут быть дифференцированы отдельные химические вещества, входящие в состав микробной клетки. Темнопольная микроскопия. При микроскопии по методу темного поля препарат освещается сбоку косыми пучками лучей, не попадающими в объектив. В обектив попадают лишь лучи, которые отклоняются частицами препарата в результате отражения, преломления или дифракции. В силу этого микробные клетки и другие частицы представляются ярко светящимися на черном фоне (картина напоминает мерцающее звездное небо).

Для микроскопии в темном поле используют специальный конденсор (параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор) и обычные объективы. Так как аппаратура иммерсионного объектива больше, чем апертура конденсора темного поля, внутрь иммерсионного объектива вставляется специальная трубчатая диафрагма, снижающая его апертуру.

Этот метод микроскопии удобен при изучении живых бактерий, спирохет и их подвижности.

Фазово-контрастная микроскопия. Обыкновенные окрашенные препараты поглощают часть проходящего через них света, в результате чего амплитуда световых волн снижается, и частицы препарата выглядят темнее фона. При прохождении света через неокрашенный препарат амплитуда световых волн не меняется, происходит лишь изменение фазы световых волн, прошедших через частицы препарата. Однако человеческий глаз улавливать это изменение фазы света не способен, поэтому неокрашенный препарат при правильной установке освещения в микроскопе будет невидим.

Фазово-контрастное устройство позволяет превратить изменение фазы лучей, прошедших через частицы неокрашенного препарата, в изменения амплитуды, воспринимаемые человеческим глазом, и, таким образом, позволяет сделать неокрашенные препараты отчетливо видимыми.

Приспособление для фазово-контрастной микроскопии включает в себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, обеспечивающих освещение препарата полным конусом света, и фазово-контрастные объективы, которые отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца, вызывающая сдвиг фазы проходящего через нее света. Установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При рассмотрении препарата весь свет, прошедший через участки препарата в которых нет каких-либо объектов, пройдет через фазовое кольцо и даст светлое изображение фона. Свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча – недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как эти лучи идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение и уменьшение амплитуды. Благодаря этому микробные клетки будут выглядеть темными на светлом фоне.

Существенными недостатками фазово-контрастной микроскопии являются слабая контрастность получаемых изображений и наличие светящихся ореолов вокруг объектов. Фазово-контрастная микроскопия не увеличивает разрешающей способности микроскопа, но помогает выявить детали структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения в них под действием различных агентов (антибиотики, химические вещества и т.д.).

Электронная микроскопия. Для изучения структуры клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной). При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов:

1) Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) - это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране. Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) - прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров). Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ. STM - scanning tunneling microscope) - прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

Современные модели электронных микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме. Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа:

1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

2) трудно быть уверенным, что объект воспроизводит живую клетку во всех ее деталях, поскольку фиксация и окрашивание исследуемого материала могут изменить или повредить ее структуру;

3) дорого стоит и сам электронный микроскоп и его обслуживание;

4) подготовка материала для работы с микроскопом отнимает много времени и требует высокой квалификации персонала;