Иммунный блот. Иммуноблоттинг на ВИЧ: особенности проведения и расшифровка результатов. Гибридизация нуклеиновых кислот

Сифилис – инфекционное венерическое заболевание, известное человечеству с XV века. В 98% случаев болезнь передается половым путем, но существуют и бытовые способы заражения. Каждому человеку в целях профилактики необходимо знать, как передается сифилис, чтобы избежать этой неприятной болезни.

Медицина выделяет несколько распространенных путей, по которым инфицируется заболевание:

• половой (самый распространенный);
• бытовой;
• гемотрансфузионный;
• профессиональный;
• стоматологический;
• молочный;
• трансплацентарный.

Сифилис может передаваться через поцелуй, кроме того, он часто распространен в среде наркоманов.

Половой путь заражения

Чаще всего заражение сифилисом происходит половым путем. К этой проблеме ведет небезопасный секс. Даже если половой акт не произошел, а были применены оральные ласки, вероятность инфицирования — 99%. Кроме того, анальный секс также относится к наиболее распространенному способу передачи. Даже с виду здоровый партнер может оказаться носителем заболевания. Самая опасная категория носителей заболевания – проститутки. Они редко задумываются о здоровом образе жизни и имеют целый букет венерических заболеваний.

ВАЖНО! Обезопасить себя от заражения можно, используя средства индивидуальной защиты – презервативы.

Разберем распространенный вопрос: «Передается ли сифилис бытовым путем?». Это не самый распространенный метод, но все же он существует. К местам инфицирования можно отнести места общего пользования, например, сауну или общественный туалет в заведении. Заразиться можно, пользуясь посудой или средствами гигиены больного. Бактерия трепонема бледная живет в окружающей среде всего несколько секунд. Но влажный воздух в бане или сауне продлевает ее жизнь на несколько минут.

Заражение инфекцией через кровь может произойти в бытовой среде, например, при рукопожатии. Такие случаи характерны для людей, чьи профессии связаны с ручным трудом. На коже образуются микроскопические ранки, через которые передается инфекция. Для предотвращения необходимо чаще мыть руки мылом, а для обработки повреждений использовать спиртосодержащие и дезинфицирующие средства.

Гемотрансфузионный путь предполагает заражение сифилисом через переливание крови. Вероятность практически сведена к нулю, так как доноры проходят тщательную проверку, но она существует. Порой пациенты после переливания крови не понимают, как заражаются сифилисом, ведь мы привыкли доверять медицинским работникам и уверены, что кровь прошла все степени проверки на наличие вирусов.

Профессиональный метод относится к категории бытовых, распространяющихся контактным путем. Чаще всего инфекция передается от зараженного пациента к врачам и медицинским сестрам. В данном случае нельзя забывать про средства индивидуальной защиты – медицинские перчатки, маску. При инъекциях нужно использовать одноразовые шприцы. Медициной зафиксированы случаи заражения сифилисом патологоанатомов при вскрытии трупа, а также случаи инфицирования санитарок кожно-венерологических отделений больницы.

Вероятность заражения инфекцией в кабинете зубного врача составляет 1-1,5%. Недобросовестный персонал не подверг инструменты должной обработке, в результате заражаются и врач, и пациент.

По статистике, 3% малолетних детей заражаются сифилисом. Медицина разделяет заражение на два вида:

• Внутриутробное заражение (через плаценту).
• Болезнь передается с молоком матери грудному ребенку (молочный путь).

Беременная женщина может не знать, что больна сифилисом, вследствие чего ребенок рождается уже инфицированным. Часто будущие мамочки заболевают уже во время беременности. Это связано с тем, что использование презерватива во время полового контакта сводится к нулю, риск заражения возрастает.

ВАЖНО! Презервативы необходимо использовать не только в целях защиты от нежелательной беременности, но и для предотвращения заражения венерическими заболеваниями.

Женские консультации, пропагандируя здоровый секс, размещают в кабинетах и холле плакаты с информацией о том, как передается сифилис и другие инфекционные заболевания.

Заражение грудного малыша при кормлении материнским молоком встречается реже, так как мамочки состоят на учете у гинеколога и периодически сдают анализы на наличие венерических болезней. Иммунная система грудничков нестабильна, поэтому риск заболевания присутствует. Единственный способ избежать заражения и не передать его ребенку – вести здоровый образ жизни, использовать средства индивидуальной защиты, вступать в половые отношения с проверенным партнером.

Заражение через поцелуй

Среди подростков все чаще возникает вопрос: «Можно ли заразиться сифилисом через поцелуй?». Отвечая на этот вопрос, не ограничимся коротким «да». Бактерии трепонемы обитают не только в сперме и мочеполовой сфере мужчин и женщин, возбудитель сифилиса содержится в крови и в слюне. При поцелуе обмен слюной происходит естественным образом. Шанс инфицирования возрастает, если во рту больного есть твердый шанкр.

Первичная сифилома (шанкр) – язва небольшого размера. Чаще шанкры наблюдаются на половых органах, встречаются во рту, на бедрах, на животе и плечах. Но даже отсутствие язв у больного человека не гарантирует, что партнер не заразится. Среди подростков, которые опасаются заниматься сексом с малознакомыми людьми, — это самый распространенный метод инфицирования. Вопрос: «Передается ли болезнь сифилис через банальный поцелуй?» — должен волновать не только молодых людей. Встречаются пары, прожившие в браке десяток лет, заразившие партнера именно через слюну.

Опасный путь заражения сифилисом встречается в среде людей, болеющих наркоманией. Если используется один шприц на двоих или троих, шанс передачи инфекции возрастает. Поэтому наркоманы состоят на учете в кожно-венерологических диспансерах и регулярно сдают анализы крови на наличие инфекционных заболеваний. Скорость распространения болезни через кровь молниеносна. Достаточно одного использования многоразовой иглы, чтобы заразиться. Известны случаи специального заражения инфицированными наркоманами здоровых людей.

Выявление заболевания

Как было сказано выше, сифилис может передаваться различными путями. При подозрении на наличие заболевания, например, после незащищенного полового контакта с малознакомым партнером, необходимо обратиться к врачу. Сдать анализ крови можно в кожно-венерологическом диспансере по месту жительства либо в любом платном медицинском центре. Неважно, каким путем вы заразились, бактерия бледная трепонема проникает в кровь в течение одного месяца и при сдаче анализов обязательно будет обнаружена.

ВАЖНО! Пройти обследование должны оба партнера.

На поздних стадиях заболевание начинает проявляться, как уже было отмечено, появлением шанкров. Инфекция проникает в лимфатические узлы, накапливается и размножается. Появление язв не сопровождается болевыми ощущениями, через некоторое время при отсутствии лечения они могут пройти самостоятельно. Сифилис входит в число заболеваний, передающихся половым, бытовым и иным путем, посредством минимального контакта зараженного со здоровым человеком. Поэтому для инфицирования достаточно считанных секунд.

Вторая стадия инфекции характеризуется попаданием трепонемы в кровь. В крови начинают скапливаться белые тельца. Такой период может длиться годами, проходя стадии обострения и ремиссии.

Наступление третьей стадии грозит появлением гумм в области половых органов, подмышек и рта. В отличие от шанкров, гуммы болезненны, причиняют инфицированному крайнее неудобство, провоцируют поражение спинного мозга и центральной нервной системы.

Особенность болезни в том, что бактерии не выживают в окружающей среде. Например, вероятность заразиться от больного человека во время его кашля или чихания сводится к нулю.

Передача сифилиса распространяется только на людей, животные не заболевают сифилисом. Бледная трепонема не терпит горячего воздуха. При температуре 60 градусов ее жизнь составляет 13-15 минут, при 100 градусах – всего 1,5-3 секунды. Низкая температура способствует ее жизни дольше. В бескислородной среде инфекция способна выжить при температуре до 170 градусов.

Можно ли заразиться сифилисом на ранних стадиях болезни? Именно начальный период является самым опасным. Появившиеся язвы в области половых органов, прямой кишки и во рту являются активными распространителями бактерий, которые моментально проникают в новое тело любым удобным путем – через кровь, сперму или слюну. Опасен такой период тем, что больной не подозревает о наличии у него инфекции, и пути заражения сифилисом могут быть абсолютно любыми. На более поздних стадиях инфицированного пациента держат под строгим контролем.

Профилактика заболевания

Пути передачи сифилиса настолько непредсказуемы, что использовать меры безопасности нужно постоянно. К профилактическим мерам следует отнести:

• здоровый образ жизни;
• сексуальный контакт только с проверенным партнером;
• использование презервативов;
• личная гигиена;
• регулярные медицинские обследования и сдача анализов;
• использование одноразовых шприцов при инъекциях;
• соблюдение правил производственной безопасности во время выполнения работ;
• искусственное вскармливание ребенка, рожденного от зараженной матери;
• посещение проверенных стоматологических кабинетов и клиник;
• при пользовании общественным туалетом использование одноразовых салфеток для унитаз;
• избегание использования чужих расчесок, зубных щеток, губной помады;
• после рукопожатия протирание ладоней спиртосодержащим раствором.

Чтобы не заболеть сифилисом, пути передачи инфекции необходимо свести к нулю. При соблюдении этих мер бактерии, которые передаются различными путями, вам не страшны.

Пропаганду венерических инфекционных заболеваний, в том числе и сифилиса ведут все медицинские учреждения. На плакатах в поликлиниках и больницах можно прочесть информацию о том, как можно заразиться сифилисом, о его разновидностях и способах протекания, узнать о том, что такое бытовой сифилис, и какие меры безопасности необходимо принять во избежание заражения.

В случае попадания инфекции в организм необходимо незамедлительно обратиться к врачу, сдать анализы. Результат станет известен через несколько дней. Медицинские клиники тщательно проверяют анализы несколько раз. Часто материал отправляется в лаборатории для подтверждения диагноза. При положительном результате и обнаружении в крови бледной трепонемы важно быстрее начать лечение, полностью исключить половые контакты и ограничить общение с окружающими людьми.

Кровь забирают из вены. Затем исследование проходит по инструкции:

• образец помещают в гель для электрофоретического разделения, в результате получают специфические белки, чувствительные к вирусу;
• на обработанный гель накладывается нитроцеллюлозная бумага;
• подготовленный образец помещают в аппарат для блоттинга.

Чтобы выявить специфические ферменты, необходимо правильно подготовить бумагу для лабораторного исследования. Для этого на нее наносят антитела и меченый радиоактивный конъюгат. Результат исследования оценивают визуально, исследуют построенные цепочки ферментов.

Расшифровка результатов

После проведенных манипуляция на бумаге остаются полосы. Они располагаются там, где произошла конъюгация, то есть нанесенный препарат вступил в реакцию с протеином вируса. Таким образом можно обнаружить части белка:

• из сердцевины ВИЧ-1 – р17, р24, р55;
• возбудителя ВИЧ-2 – р16, р26, р56.

Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если обнаружено 2 из 3 протеина ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Так как часто вестерн-блот (второе название исследования) используют для подтверждения положительного ИФА, то реакцию проверяют на специфические протеины: gp120/160, gp41 или р24. Они являются частью трех основных генов СПИДа – gag, pol, and env. При первичной диагностике проверка проводится только на белки р25, gp110/120 и gp160, если она дала положительный результат, то проверку проводят на р24. Эта часть белка позволяет обнаружить вирус на ранней стадии.

Положительный результат – повод обратиться за более сложной диагностикой. Он бывает ложным только в 3-х случаях:

• у пациентов с высоким уровнем билирубина;
• при контакте с вирусными антигенами;
• при патологиях соединительной ткани.

Если у пациента нет линий, соответствующих белкам СПИДа, то результат оценивают как отрицательный. Это означает, что человек не заражен ВИЧ или он находится в «периоде окна». Последнее означает, что вирус мог попасть в организм, но еще не развиться в нем. Чтобы повысить точность диагностики, используются тест-системы:

• Рекомбинат-ВИЧ;
• Антиген;
• Пептоскрин.

После проверки на них результат засчитывается за отрицательный, если в образце не найдены белки gp120, gp160, Sp4.

Есть еще один вариант интерпретации – нейтральный или сомнительный результат. Он встречается у тех, кто вступил в сексуальный контакт с ВИЧ-инфицированным партнером. В их крови находят антитела к белкам gp120 и gp160. Также сомнительный ответ при блоттинге дают, когда инфекция протекает бессимптомно, то есть находится в спящем состоянии.

Сомнительный результат важно подвергнуть тщательной проверке. Для этого используют исследование сыворотки крови в динамике, то есть регулярные проверки методами иммунноблоттинга и ИФА в течение полугода. Также назначаются дополнительные обследования, так как присутствие в крови аутоантител и иммунных комплексов может быть обусловлено:

• инфекционными заболеваниями;
• наличием раковых опухолей;
• аллергией.

Иммуноблоттинг (иммуноблот) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РИГА или ИФА. Иммуноблоттинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов -появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

ООО "Лабораторная диагностика" использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы "EUROIMMUN" (Германия), "MIKROGEN" (Германия):

ВПГ 1 и ВПГ 2 IgM/IgG (герпесвирусная инфекция)

ЦМВ IgM/IgG (цитомегаловирусная инфекция)

Краснуха IgG

TORCH-профиль IgM (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

ВЭБ IgMTIgG (вирусная инфекция Эпштейна-Барра)

ВГС IgG (вирусный гепатит С)

Используют наборы двух типов - вестерн-блот и лайн-блот.

Вестерн-блот: Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы. На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Лайн-блот: В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе.

Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. Современный высокочувствительный метод заключается в идентификации белков, в том числе вирусных антигенов. Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител. В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:

1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины, этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE; разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;

2) разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на
нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; во многих случаях, но
не всегда, при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

3) на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные
антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для
обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую
меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг
аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.

Следует иметь в виду, что в данной постановке иммуноблотинга белки находятся в денатурированном состоянии, и поэтому могут не распознаваться антителами, специфическими по отношению к нативному белку, но зато при наличии сывороток ко всем составляющим пептидам одновременно выявляется весь антигенный спектр испытуемого белка. Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами. Высокая разрешающая способность иммуноблотинга позволяет получать хорошие результаты и в диагностической практике, когда требуется идентифицировать вирус в тканях или экскретах больного.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,- РНК и белок - блоттинг.

Иммунохимическое выявление антигенов можно проводить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В качестве метки в последнее время широко применяют либо радиоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36-48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей - электроблот, время которого, в основном, составляет 1-3 ч, для некоторых высокомолекулярных белков- более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от антигена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследования.

Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам возбудителя позволяет оценить значимость этих антител (специфичность для данного этиологического агента), исключить реакцию на перекрестные антигены. Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут быть использованы различные комбинации антигенных детерминант - как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции с другими возбудителями. В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в случае иммуноблоттинга это доказательно

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наибольшее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода - возможность тестирования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в антигены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному количеству нанесенного на гель антигена, которое при фракционировании белков удается выявить иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу). Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом носителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител. Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.

Большие трудности интерпретации результатов перекресных при реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии. В первой ситуации при повторном исследовании через промежуток определенный времени антитела не выявляются, а во в втором иммуноблоте появляются новые полосы, свидетельствующие о антител появлении к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя ответной динамику иммунной реакции на антигены вируса.

Является фактически конечным верификационным методом в цепи серологических исследований, позволяющих сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности пациента или же отвергнуть таковую. Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза заранее перенесены белки ВИЧ в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела испытываемых сывороток взаимодействуют с белками определенных зонах полоски. Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски (стрипа) конъюгатом и хромоген-субстратом с отмыванием не связавшихся компонентов и прекращением реакции дистиллированной водой. Предварительное электрофоретическое разделение белков и их фиксация на нитроцеллюлозе позволяет идентифицировать антитела к конкретным белкам в соответствии с наличием (или отсутствием) окрашивания (серовато-голубого) соответствующих зон полоски. Иммуноблотинг не может использоваться для массового скрининг исследования вследствие высокой стоимости и является методом индивидуального арбитража на заключительном этапе серологического исследования.

Существует достаточно четкие корреляции между результатами исследования сывороток в ИБ и ИФА. Дважды положительные в ИФА (в разных тест-системах) сыворотки интерпретируются затем в ИБ как ВИЧ-позитивные в 97-98% случаев. Сыворотки, положительные в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-системах, оказываются ВИЧ-позитивными в ИБ не чаще, чем в 4% случаев. При проведении подтверждающих исследований около 5% ИБ могут давать так называемые "неопределенные" результаты, которым, как правило, соответствуют положительные ИФА, но не РИП. Примерно в 20% случаев "неопределенные" ИБ вызывают антитела к gag- белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). При получении сомнительных результатов иммуноблотинга необходимо исследование повторить через 3 месяца и при сохранении неопределённости результата - через 6 месяцев.

Радио-иммунный метод (РИМ)(Радиоиммунологический анализ, РИА) Радиоиммунный анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

С помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” - Австрия II-I 125 удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0, 1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”). Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках - радиоспектрометрах. Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции. Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Таблица 1.Классификация вакцин

Список литературы:

Обязательная:

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А.,Сидорович И.Г. Иммунология:Учебник.-М.:Медицина,2000.- 432 с: ил.(Учеб. лит. для студ. медвузов).

2. Ковальчук Л.В и др. Иммунология: практикум: учеб. пособие – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 с.

3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 768 с.

4. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.

Дополнительная:

1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов.- 3-е издание, испр. и доп. – СПб, СпецЛит. 2002. – 591 с.

3. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.

4. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Полоска А - Положительный контроль

Полоска В - Слабоположительный контроль

Полоска С - Отрицательный контроль

Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).